好熱好酸性アーキアSulfolobus tokodaii由来シスタチオニンγ－シンターゼの精製及び性質検討

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  • コウネツ コウサンセイ アーキア Sulfolobus tokodaii ユライ シスタチオニン ガンマ シンターゼ ノ セイセイ オヨビ セイシツ ケントウ

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好熱好酸性アーキアSulfolobus tokodaii由来シスタチオニンγ－シンターゼ（stCGS）遺伝子をpET-11aに組み込みpET-stCGSを構築した。このベクターでE. coli Rosetta-gami（DE3）を形質転換し、本遺伝子を発現させ、精製及び性質検討を行った。大腸菌で発現したシスタチオニンγ－シンターゼの活性が無細胞抽出液で確認できた。S. tokodaiiシスタチオニンγ－シンターゼを70℃熱処理DEAE－トヨパールイオン交換カラム等により単一精製した。精製酵素の最適温度は100℃以上であり、熱安定性は60分間処理で70℃までほぼ100％の残存活性を示した。また、最適pHについてはリン酸緩衝液やブリトン－ロビンソン広域緩衝液の場合はpH7.0の時が最も活性が高く、トリス塩酸緩衝液の場合はpH9.0が最適であった。pH安定性についてはpH5.0〜9.0において安定であった。O－ホスホ－L－ホモセリンに対するKm、Vmaxは、それぞれ0.82mM、2.42U／mgであった。アポ酵素のホロ化実験により、本酵素活性がPLPに依存していることが明らかとなった。更に本酵素の脱離反応での基質特異性の検討を行った。変異酵素を用いた実験により、stCGSの基質特異性には、活性中心に存在するPhe97を含む領域が深く関わっていることが示唆された。

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