Effects of heparin on the time course of sperm penetration during in vitro fertilization in sheep

Effects of heparin on in vitro capacitation of ovine fresh ejaculated and frozen-thawed spermatozoa were examined. Fresh ejaculated or frozen-thawed spermatozoa from one ram were washed once and incubated in glucose-free defined medium supplemented with or without 10μg/ml heparin for 1 hr at 39℃ and 5％ CO_2 in air. Then spermatozoa were added to in vitro matured ovine oocytes and incubated for an additional 1 to 23 hours at 39℃ and 5％ CO_2 in air. A glucose-free medium supplemented with or without 10μg /ml heparin was used as the fertilization medium. In vitro capacitation of fresh ejaculated and frozen-thawed spermatozoa without heparin treatment resulted in very low penetration rates up to 7 hours after insemination (8％ and 9％, respectively). At 23 hours after insemination, 59％ (fresh, ejaculated) and 86％ (frozen-thawed) of oocytes were penetrated, but 50％ (fresh ejaculated) and 31％ (frozen-thawed) of the penetrated oocytes showed signs of delayed fertilization (with intact sperm head or enlarged sperm head). When heparin was used for induction of in vitro capacitation, penetration rates were 43 and 59％ at 7 hours, and 90 and 83％ at 23 hours with fresh ejaculated and frozen-thawed spermatozoa, respectively. Ninety two percent (fresh) and 100％ (frozen-thawed) of the penetrated oocytes progressed to the pronucleus stage or prior to first cleavage. These results, therefore indicate that heparin potentially induces the capacitation of ovine fresh ejaculated and frozen-thawed spermatozoa in vitro.　　（和文）　本研究においては、ヒツジ新鮮射出精子および凍結融解精子の受精能獲得に対するヘパリンの効果を検討した。雄ヒツジから採取された新鮮射出精子および-196℃で一度凍結保存した凍結融解精子を、ヘパリンを10μg/mlの濃度で添加・無添加のグルコース欠Defined medium で一度洗浄後、39℃ 、5％ CO_2 in air の条件下で1時間培養した。その精子を、体外成熟したヒツジ卵子を含む受精用培養液のスポットに導入して授精を行ない、更に39℃ 、5％ CO_2 in air の条件下で1から23時間培養を継続した。受精用培養液には、ヘパリンを10μg/ml の濃度で添加・無添加のグルコース欠 Defined medium を用いた。ヘパリンを含む培養液で培養せず、受精用培養液にもヘパリンを含まなかった新鮮射出精子および凍結融解精子においては、授精後7時間目においても非常に低い卵子への精子侵入率を示した (各8％と9％)。同じ処理区で、授精後23時間目では、59％(新鮮射出精子)および86％(凍結融解精子)と卵子への精子侵入率も上昇したが、それぞれの精子侵入した卵子において、50％および31％のものが非膨化精子頭部または膨化精子頭部を持ち、精子の侵入が遅れておこったと考えられた。これに対して、10μg/ml ヘパリンを含む培養液で培養し、受精用培養液にもヘパリンを含んだ新鮮射出精子および凍結融解精子においては、授精後7時間目での卵子への精子侵入率は新鮮射出精子および凍結融解精子においてそれぞれ、43％と59％であった。また授精後23時間目での卵子への精子侵入率はそれぞれ90％および83％と高く、更にそれら侵入した精子の頭部の、92％(新鮮射出精子)、100％(凍結融解精子)が、雄性前核形成かそれ以降の段階へ進んでいた。以上の結果より、ヘパリンはヒツジ新鮮射出精子および凍結融解精子の受精能獲得に有効であることが示された。