氷核活性細菌特異的抗血清の作出とその検出方法

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  • ヒョウカク カッセイ サイキン トクイテキ コウケッセイ ノ サクシュツ ト

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氷核活性細菌の消長を調べるための簡便な検出法として血清学的検出法を開発した。Pseudomonas syringae S203由来の氷核遺伝子inaZの配列を基にして，PCR法によりinaZの開始コドンから終止コドンまでを増幅するように2本のプライマーをデザインした。P. syringae No. 90のゲノムDNAと上記の2本のプライマーを用いてPCR(polymerase chain-reaction)を行った結果，約3,600bpのDNA断片(ina90)が増幅された。PCR産物を大腸菌発現ベクターに組込み，大腸菌に導入したところ，組換え大腸菌は，氷核活性を示した。さらにglutathion S-transferase (GST)とina90の5'端から約1,200bpの断片(ina90')との融合タンパクを大量に発現するようにベクターを構築し，大腸菌に導入した。その結果，組換え大腸菌は，大量の融合タンパクを発現した。融合タンパクをGSTとIna90'タンパクとに切断し， Ina90'タンパクのみSDS-PAGEを行ったゲルのバンドから回収した。精製したIna90'タンパクを抗原としウサギに免役して得られた抗血清は，32,000倍までP. syringae No. 90および組換え大腸菌と反応した。また，2属，9種，38菌株の細菌に対して反応させた結果，氷核活性のある菌株に対してのみ特異的に反応した。氷核活性細菌を散布したキャベツ実生苗から葉を採集し，ニトロセルロースメンブレンに押しつけ，抗血清と反応させた。その結果，葉上における氷核活性細菌の存在場所がメンブレン上のスポットとして検出された。

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