P(論文)

ヒドロキシクエン酸(HCA)は熱帯性植物であるガルシニア(Garcinia cambogia)、ハイビスカス(Hibiscus subdariffa Linn.)に主に含まれる有機酸である。HCAには4種の光学異性体(2S,3S)、(2R,3R)、(2S,3R)、(2R,3S)型が存在する。G. cambogiaには(2S,3S) -HCAが、H. subdariffa Linn.には(2S,3R) -HCAのみが含まれており(2S,3S)-HCAは動物体内で脂肪合成の経路に関わる酵素、ATPクエン酸リアーゼを競争阻害し、脂肪の合成を抑制する。(2S,3R)-HCAは膵臓のα-アミラーゼ、α-グルコシダーゼを阻害し、血糖値上昇を抑える作用がある。本研究ではこの一部の亜熱帯性植物のみにしか存在が知られていないHCAを生産する微生物をスクリーニングし、その生産性を向上させることを目的とした。まずガルシニア並びにハイビスカスからHCAをメチルエステル体として精製したのち加水分解しスクリーニング標品とした。次いで自然界から単離した微生物約2,000株からHPLCを用いて生産菌をスクリーニングした。Streptomyces属とBacillus属の候補菌株2株を大量培養し、培地上清からHCAをメチルエステル体として精製した。それらの^1H-NMRスペクトルはハイビスカス由来のHCAメチルエステルと一致した。次いでこれらの絶対構造を決定するため、HCAメチルエステルを合成し、キラルカラムを用いて各異性体を分離できる条件を確立した。分析の結果上記微生物が生産するHCAはハイビスカス型の(2S,3R) -HCAであることが判明した。次いでゲノムシャッフリングによる高生産株の取得を試みた。Streptomyces属の胞子、Bacillus属をNTGまたはUV処理し、得られた変異株からプロトプラストを調製した。これらのプロトプラストを再生させた後、HCAの生産性が向上した変異株を単離した。これらはエポキシアコニット酸に対する耐性が上昇し、3回に渡るゲノムシャフリングで元の株の約5-13倍のHCA生産性向上が認められた。以上ヒドロキシクエン酸を生産する微生物を初めて同定し、ゲノムシャッフリングによりHCA増産株を育成した。

The tropical plants Garcinia cambogia and Hibiscus subdariffa produce hydroxycitric acid (HCA) and their absolute configurations are (2S, 3S) and (2S, 3R)-HCA respectively. HCA logically has four stereoisomers, (2S, 3S), (2R, 3R), (2S, 3R), (2R, 3S) and their lactone forms. Therefore, chemical synthesis of natural type HCA is difficult. (2S, 3S)-HCA is proved to be on inhibitor of ATP-citrate lyase, which is involved in fatty acid synthesis. (2S, 3R)-HCA inhibits pancreatic a-amylase and intestine a-glucosidase, leading to reduction of carbohydrate metabolism. In this study, microbial production of HCA was attempted to supply large amount of optically pure HCA. At first, (2S, 3S) and (2S, 3R)-HCA were prepared from Garcinia and Hibiscus, and were used as authentic samples for HPLC analysis. From about 2000 microbial isolates, Streptomyces sp. U121 and Bacillus megaterium G45C were found to produce trace amount of HCA, which was transformed to the methyl ester and purified. 1H-NMR of these methyl ester were identical to that of Hibiscus-type HCA diastereoisomer. Additionally, the results of HPLC analysis with a chiral column suggested the absolute configuration of these HCA was (2S, 3R). Spores of Streptomyces sp. U121 and cells of Bacillus megaterium G45C were treated with NTG or irradiated with UV to give HCA hyperproducing mutants. These mutants were further improved by genome shuffling. Mutants obtained after three rounds of genome shuffling showed enhanced resistance to epoxyaconitic acid, and produced 5 to 13 times amount of HCA. Consequently, for the first time, we succeeded in the isolation of HCA-producing microorganisms from nature. We also successfully improved the productivity of HCA by mutagenesis of wild strains by subsequent genome shuffling.