遺伝子組換え植物における導入遺伝子発現用プロモーターに関する研究

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  • イデンシ クミカエ ショクブツ ニ オケル ドウニュウ イデンシ ハツゲンヨウ プロモーター ニ カンスル ケンキュウ

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抄録

遺伝子組換え技術を利用した植物の改良において、導入遺伝子の発現を適切に制御するプロモーターの開発が必要不可欠である。遺伝子組換え植物では、予期しない導入遺伝子及びこれに相同性のある内在性遺伝子の発現抑制（ジーンサイレンシング）が起こることがあり、その機構を解明する必要がある。代表的な導入遺伝子発現用プロモーターとして広く用いられているカリフラワーモザイクウイルス由来35SRNAプロモーター（P35S）を改変し、高発現を可能にしたプロモーターが開発されている。本研究では、これをホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子に連結し、導入したタバコで起きるジーンサイレンシングの様相を詳細に解析した。その結果、このジーンサイレンシングは、活発な細胞分裂により一旦解除されて、次世代には移行せず、生育中に新たに開始することが明らかとなった。また、P35S改変高発現プロモーターを用いて形質転換キクを作出したところ、全ての個体において導入遺伝子の発現が認められなかった。原因の解明を試みた結果、導入遺伝子のメチル化が関与していると考えられた。予期しないジーンサイレンシングを回避するための一つの手段として、同一の植物形質転換用ベクター内に相同性のある遺伝子配列の反復使用を避けることが望ましい。しかしながら、現状では利用可能なプロモーターが限られているため、目的遺伝子と選抜マーカー用遺伝子に同じプロモーターを繰り返し使用することが多い。これを解決するために、P35Sと代替可能なプロモーターの開発を行った。遺伝子の解析を目的として既に単離・解析されている植物由来のプロモーターをデータベースで検索し、利用可能と考えられたシロイヌナズナ由来のトリプトファン合成酵素βサブユニット遺伝子のプロモーター（PSB1）及びフィトクロームB遺伝子のプロモーター（PPHYB）を選出した。PSB1及びPPHYBを各々GUS遺伝子及びカナマイシン耐性遺伝子に連結し、タバコに導入して実用性を評価したところ、これらはP35Sに匹敵するプロモーターとして有用であることが示された。PSB1を抗菌性タンパク質であるエンバク由来チオニン遺伝子に連結し、カーネーションに導入したところ、得られた形質転換体においてカーネーション萎凋細菌病抵抗性が付与された。次に、新奇性・利用性の高いプロモーターを得ることを目的として、1本鎖DNAウイルスであるレンゲ萎縮ウイルスに由来する11種類のプロモーターについて、形質転換タバコにおける発現特性を明らかにした。これらのうち最も構成的に近い発現を示した細胞間移行タンパク質遺伝子のプロモーターPMC8の発現様式をさらに詳細に解析した結果、PMC8が双子葉植物のタバコだけでなく、単子葉植物のイネにおいても発現するP35Sと代替可能なプロモーターとして有用であることが示された。

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