Rice Golgi Proteome : Identification and Characterization of N-acetylglucosaminyltransferase-I-like Protein

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  • イネゴルジ体プロテオーム ： N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ-Ⅰ様タンパク質の同定と機能解析

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A shotgun proteomic analysis of the nucleoside diphosphatase (NDPase)-associated Golgi membranes isolated from ricesuspension-cultured cells was performed by multi-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The Golgimembranes contained an N-acetylglucosaminyltransferase-I-like protein, in addition to reversibly glycosylated polypeptide,putative xylosyltransferase and vacuolar sorting receptor. N-acetylglucosaminyltransferase-I-like protein (GNTI-LP)synthesized by a cell-free transcription/translation system from the cDNA clone catalyzed the reaction forming (GlcNAcβ1-2)(Manα1-6) (Manα1-3) (Man)3- (GlcNAc)2- PA from (Manα1-6) (Manα1-3) (Man)3- (GlcNAc)2- PA and UDP-GlcNAc, indicatingthat the protein is an N-acetylglucosaminyltransferase-Ⅰ. The optimal pH for the enzyme reaction was 8.0, but the enzymeactivity was expressed at a broad pH range between 5 and 8. The optimal temperature was 30℃. The enzyme requiredMn2+ and Mg2+, and the activity was inhibited with EDTA. The Km value for UDP-GlcNAc was determined to be 0.58 μM.Furthermore, the N-terminal region including a transmembrane domain (M1 to Q120) was not essential for the enzymeactivity. Western blot analyses with anti-GNTI-LP revealed that the Golgi membranes actually accumulate a protein thatmigrates as a 51 kDa band in SDS gels.

イネ培養細胞から単離したNDPase- 結合ゴルジ体膜のショットガンプロテオミック解析を多次元液体クロマトグラフタンデム質量分析装置を用いて行った。ゴルジ体膜には可逆性グリコシル化ポリペプチド、キシロシルトランスフェラーゼ、液胞選別レセプターに加えて、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼI 様タンパク質（GNTI-LP）が含まれていた。無細胞転写・翻訳系を用いてcDNA クローンから合成したGNTI-LP は、（Manα1-6）（Manα1-3）（Man）3（- GlcNAc）2-PA とUDP-GlcNAc から（GlcNAcβ1-2（）Manα1-6（）Manα1-3（）Man)3（- GlcNAc）2-PA を形成する反応を触媒し、N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼⅠであることが明らかになった。酵素反応の至適pH は8.0であるが、酵素活性はpH 5からpH 8の広い範囲で維持された。また、至適温度は30℃であった。酵素はMn2+ とMg2+ を要求し、EDTA により活性が阻害された。UDP-GlcNAc に対するKm 値は0.58 μM を示した。さらに、膜貫通ドメインを含むN 末端領域（M1からQ120）は酵素活性に必須ではないことが分かった。抗GNTI-LP 抗体を用いたウエスタンブロット解析によりゴルジ膜は確かにSDS ゲル中で51 kDa のバンドとして泳動されるタンパク質を蓄積することが明らかになった。

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