Capsular polysaccharide inhibits adhesion of Bifidobacterium longum 105-A to enterocyte-like Caco-2 cells and phagocytosis by macrophages

Bifidobacterium longum 105-A produit des quantités nettement élevées de polysaccharides capsulaires (CPS) et d'exopolysaccharides (EPS) qui devraient jouer des rôles distincts dans les interactions bactérie-hôte. Pour identifier la fonction biologique de B. longum 105-A CPS/EPS, nous avons réalisé une étude informatique du génome et identifié le locus génétique codant pour l'EPS de B. longum 105-A qui est responsable de la production de CPS/EPS. Le rôle de CPS/EPS dans l'adaptation à l'environnement du tractus intestinal et aux interactions bactéries-cellules intestinales a été étudié en utilisant le mutant ΔcpsD. Il a été démontré qu'un groupe de gènes putatifs de B. longum 105-A CPS/EPS se compose de 24 gènes putatifs codant pour une glycosyltransférase d'amorçage (cpsD), 7 glycosyltransférases, 4 protéines de la machinerie de synthèse CPS/EPS et 3 enzymes de synthèse dTDP-L-rhamnose. Ces enzymes doivent former un système complexe qui est impliqué dans la biogenèse du CPS et/ou de l'EPS. Pour le confirmer, nous avons construit un mutant knock-out (ΔcpsD) par une double recombinaison homologue cross-over. Comparé au type sauvage, le mutant ∆cpsD a montré un taux de croissance similaire. Cependant, il a montré une sédimentation plus rapide et la formation d'amas cellulaires en culture liquide. L'EPS a été sécrété par le mutant ∆cpsD, mais a modifié la composition et le poids moléculaire des monosaccharides. La comparaison de la morphologie de B. longum 105-A sauvage et ∆cpsD par coloration négative en microscopie photonique et électronique a révélé que la formation de fimbriae est considérablement augmentée chez le mutant ∆cpsD alors que le B. longum 105-A sauvage était recouvert d'une capsule épaisse. L'expression des fimbriae dans l' ∆cpsD était étroitement associée à la disparition de la couche CPS. Le type sauvage présentait une faible tolérance au pH, une faible adaptation et une faible tolérance aux sels biliaires, mais le mutant ∆cpsD avait perdu cette capacité de survie dans les environnements gastrique et duodénal. Le mutant ∆cpsD était largement capable de se lier à la lignée cellulaire Caco-2 du carcinome du côlon humain et était phagocyté par le macrophage murin RAW 264.7, tandis que le type sauvage ne se liait pas aux cellules épithéliales et résistait totalement à l'internalisation par les macrophages. Nos résultats suggèrent que la production de CPS/EPS et la formation de fimbriae sont négativement corrélées et jouent des rôles clés dans la survie, l'attachement et la colonisation de B. longum 105-A dans l'intestin.

Bifidobacterium longum 105-A produce cantidades marcadamente altas de polisacáridos capsulares (CPS) y exopolisacáridos (eps) que deberían desempeñar papeles distintos en las interacciones bacteria-huésped. Para identificar la función biológica de B. longum 105-A CPS/eps, realizamos un estudio informático del genoma e identificamos el locus genético que codifica eps de B. longum 105-A que es responsable de la producción de CPS/eps. El papel de CPS/eps en la adaptación al entorno del tracto intestinal y las interacciones entre las bacterias y las células intestinales se investigó utilizando el mutante ΔcpsD. Se demostró que un supuesto grupo de genes CPS/eps de B. longum 105-A consiste en 24 supuestos genes que codifican una glicosiltransferasa de cebado (cpsD), 7 glicosiltransferasas, 4 proteínas de la maquinaria de síntesis de CPS/eps y 3 enzimas de síntesis de dTDP-L-ramnosa. Estas enzimas deben formar un sistema complejo que esté involucrado en la biogénesis de CPS y/o eps. Para confirmar esto, construimos un mutante knockout (ΔcpsD) mediante una recombinación homóloga de doble cruce. En comparación con el tipo salvaje, el mutante ∆cpsD mostró una tasa de crecimiento similar. Sin embargo, mostró una sedimentación más rápida y la formación de grupos de células en cultivo líquido. El eps fue secretado por el mutante ∆cpsD, pero tenía una composición de monosacáridos y un peso molecular alterados. La comparación de la morfología de B. longum 105-A de tipo salvaje y ∆cpsD mediante tinción negativa en microscopía óptica y electrónica reveló que la formación de fimbrias se mejora drásticamente en el mutante ∆cpsD mientras que B. longum 105-A de tipo salvaje se recubrió con una cápsula gruesa. La expresión de fimbrias en la ∆cpsD estuvo estrechamente asociada con la desaparición de la capa CPS. El tipo salvaje mostró baja tolerancia al pH, adaptación y tolerancia a las sales biliares, pero el mutante ∆cpsD había perdido esta capacidad de supervivencia en entornos gástricos y duodenales. El mutante ∆cpsD fue ampliamente capaz de unirse a la línea celular Caco-2 de carcinoma de colon humano y fue fagocitado por el macrófago murino RAW 264.7, mientras que el tipo salvaje no se unió a las células epiteliales y resistió totalmente la internalización por los macrófagos. Nuestros resultados sugieren que la producción de CPS/eps y la formación de fimbrias están correlacionadas negativamente y desempeñan un papel clave en la supervivencia, el apego y la colonización de B. longum 105-A en el intestino.

Bifidobacterium longum 105-A produces markedly high amounts of capsular polysaccharides (CPS) and exopolysaccharides (EPS) that should play distinct roles in bacterial–host interactions. To identify the biological function of B. longum 105-A CPS/EPS, we carried out an informatics survey of the genome and identified the EPS-encoding genetic locus of B. longum 105-A that is responsible for the production of CPS/EPS. The role of CPS/EPS in the adaptation to gut tract environment and bacteria-gut cell interactions was investigated using the ΔcpsD mutant. A putative B. longum 105-A CPS/EPS gene cluster was shown to consist of 24 putative genes encoding a priming glycosyltransferase (cpsD), 7 glycosyltransferases, 4 CPS/EPS synthesis machinery proteins, and 3 dTDP-L-rhamnose synthesis enzymes. These enzymes should form a complex system that is involved in the biogenesis of CPS and/or EPS. To confirm this, we constructed a knockout mutant (ΔcpsD) by a double cross-over homologous recombination. Compared to wild-type, the ∆cpsD mutant showed a similar growth rate. However, it showed quicker sedimentation and formation of cell clusters in liquid culture. EPS was secreted by the ∆cpsD mutant, but had altered monosaccharide composition and molecular weight. Comparison of the morphology of B. longum 105-A wild-type and ∆cpsD by negative staining in light and electron microscopy revealed that the formation of fimbriae is drastically enhanced in the ∆cpsD mutant while the B. longum 105-A wild-type was coated by a thick capsule. The fimbriae expression in the ∆cpsD was closely associated with the disappearance of the CPS layer. The wild-type showed low pH tolerance, adaptation, and bile salt tolerance, but the ∆cpsD mutant had lost this survivability in gastric and duodenal environments. The ∆cpsD mutant was extensively able to bind to the human colon carcinoma Caco-2 cell line and was phagocytosed by murine macrophage RAW 264.7, whereas the wild-type did not bind to epithelial cells and totally resisted internalization by macrophages. Our results suggest that CPS/EPS production and fimbriae formation are negatively correlated and play key roles in the survival, attachment, and colonization of B. longum 105-A in the gut.

تنتج Bifidobacterium longum 105 - A كميات عالية بشكل ملحوظ من السكريات المحفظة (CPS) والسكريات الخارجية (EPS) التي يجب أن تلعب أدوارًا متميزة في التفاعلات البكتيرية المضيفة. لتحديد الوظيفة البيولوجية لـ B. LONGUM 105 - A CPS/EPS، أجرينا مسحًا معلوماتيًا للجينوم وحددنا الموضع الجيني لترميز EPS لـ B. LONGUM 105 - A المسؤول عن إنتاج CPS/EPS. تم التحقيق في دور CPS/EPS في التكيف مع بيئة القناة الهضمية وتفاعلات خلايا البكتيريا والأمعاء باستخدام طفرة ΔcpsD. تبين أن مجموعة جينات B. longum 105 - A CPS/EPS تتكون من 24 جينًا مفترضًا يشفر ناقلة جليكوسيل أولية (cpsD)، و 7 ناقلة جليكوسيل، و 4 بروتينات آلية تخليق CPS/EPS، و 3 إنزيمات تخليق dTDP - L - rhamnose. يجب أن تشكل هذه الإنزيمات نظامًا معقدًا يشارك في التكوين الحيوي لـ CPS و/أو EPS. لتأكيد ذلك، أنشأنا طفرة بالضربة القاضية (ΔcpsD) عن طريق إعادة التركيب المتشابهة المزدوجة. وبالمقارنة مع النوع البري، أظهرت طفرة "cpsD" معدل نمو مماثل. ومع ذلك، أظهر ترسيبًا وتشكيلًا أسرع لمجموعات الخلايا في المزرعة السائلة. تم إفراز EPS بواسطة طفرة cpsD، لكنها غيرت تركيبة السكريات الأحادية والوزن الجزيئي. كشفت مقارنة مورفولوجيا B. longum 105 - A من النوع البري و cpsD عن طريق التلوين السلبي في المجهر الضوئي والإلكتروني أن تكوين الخميلة يتحسن بشكل كبير في طفرة cpsD بينما تم طلاء B. longum 105 - A من النوع البري بكبسولة سميكة. كان التعبير الخملي في cpsD مرتبطًا ارتباطًا وثيقًا باختفاء طبقة CPS. أظهر النوع البري تحملًا منخفضًا لدرجة الحموضة والتكيف وتحملًا للملح الصفراوي، لكن طفرة "cpsD" فقدت هذه القدرة على البقاء في بيئات المعدة والاثني عشر. كانت طفرة "cpsD" قادرة على نطاق واسع على الارتباط بسلالة خلايا سرطان القولون البشري Caco -2 وتم بلعمتها بواسطة الضامة الفأرية الخام 264.7، في حين أن النوع البري لم يرتبط بالخلايا الظهارية وقاوم تمامًا الاستيعاب بواسطة الضامة. تشير نتائجنا إلى أن إنتاج CPS/EPS وتشكيل الخميلة مرتبطان سلبًا ويلعبان أدوارًا رئيسية في بقاء وتعلق واستعمار B. longum 105 - A في الأمعاء.