ゼオシンベクターを用いた放射線感受性遺伝子新規探索法の開発

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  • A novel strategy to isolate radiosensitive gene using Zeocin vector

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これまでに報告されている放射線感受性関連遺伝子の単離・同定法の例には、放射線高感受性遺伝病の原因遺伝子の同定を始め、モデル生物から同定された放射線感受性遺伝子のホモログ同定、分子間の相互作用を解析する生化学的手法、発現に差異のある遺伝子を単離するディファレンシャルディスプレイ法、サブトラクション法などがある。しかし、これらの方法にはそれぞれの単離手法による特性があり、我々はより効率的な新しいアプローチによる遺伝子単離法の開発を目指した。 RAZE法（Radiosensitivity-related gene cloning using Zeosin vector）と名付けたこの手法の特徴は、ゼオシン発現ベクターをランダム挿入することにより遺伝子改変を起こさせた細胞群を、ゼオシン含有培地で選択することにより、DNA損傷抵抗性のクローンを効率良く得る点にある。我々は放射線高感受性のヒトT細胞性白血病細胞株MOLT-4細胞に、独自に開発したゼオシンベクターを導入した。開発したベクターは、後の遺伝子配列の特定に適した設計となっており、ゼオシン抵抗性遺伝子の両端に多数の制限酵素サイトを有するベクターである。得られたクローンの放射線照射後の生存率を測定すると、親株であるMOLT-4の2倍以上の生存率を示すクローンが複数得られた。リアルタイムPCR定量の結果、各クローンのゼオシン挿入量が放射線抵抗性と相関しないことから、獲得した放射線抵抗性はベクター挿入による遺伝子改変が原因であると考えられた。よってこれらのクローンのベクター挿入部位をinverse PCR（IPCR）法で同定した。制限酵素サイトを多く含むベクターの挿入により、未知配列を含む挿入部位のIPCR増幅に適したゲノム断片を得る事が出来、目的の遺伝子配列を単離する事に成功した。今後は単離した候補遺伝子の機能解析を進める予定である。 1

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