リアルタイム定量PCR法によるダイズ葉焼病菌のダイズ種子からの絶対定量

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  • Detection and absolute quantification of <i>Xanthomonas axonopodis</i> pv. <i>glycines</i> from soybeans by real-time PCR.
  • リアルタイム定量PCR法によるダイズ葉焼病菌のダイス種子からの絶対定量
  • リアルタイム テイリョウ PCRホウ ニ ヨル ダイズ ヨウショウビョウキン ノ ダイス シュシ カラ ノ ゼッタイ テイリョウ
  • Detection and absolute quantification of Xanthomonas axonopodis pv. glycines from soybeans by real-time PCR.

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抄録

TaqManプローブ法に基づくリアルタイム定量PCR（qPCR）を利用して，ダイズ種子中のダイズ葉焼病菌（Xanthomonas axonopodis pv. glycines）を絶対定量する実験系を確立した．プライマー・プローブはrpoD遺伝子を標的として設計した．その特異性について検討したところ，供試した61株の本菌からは増幅が認められたが，Xanthomonas属の近縁細菌や，ダイズ由来の対照菌株・常在細菌からは全く増幅しなかった．絶対定量を行うために必要な検量線は，本菌の懸濁液の10倍希釈系列を用い，ダイズ種子1 gに対して添加回収試験（澤田ら，植物防疫 62: 611-617，2008）を行うことによって作成した．その結果，6×108～6×102 cfu／種子1 gの範囲で強い直線性と適正なPCR効率が得られることから，少なくともこの範囲において精度の高い定量実験が可能である．また，本法を用いて定性的な検査を行う場合の検出下限は，約6×101 cfu／種子1 g近くまでさかのぼる可能性が認められた．さらに，1 kgの「検体」の保菌程度を把握するためには，以下の1）～4）に示した手順に従って，検体の中からqPCR実験に供する「分析用試料」を採取すれば良いことが確認できた．すなわち，1）1 kgのダイズ種子（＝検体）を粉砕して十分に混和する，2）「1 kgの粉砕種子から1 g（＝分析用試料）を採取する」という操作を10回繰り返す，3）採取した1 gの粉砕種子ごとにDNAを抽出した後，qPCRを3反復行って定量値を求める，4）得られた30個の定量値を平均し，その値をもとに「検体」の保菌程度を判定する．<br>

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