ストレプトアビジン修飾磁性微粒子を利用したDNA点突然変異の解析

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  • Single point mutation analysis using magnetic beads coated with streptavidin
  • ストレプトアビジン シュウショク ジセイ ビリュウシ オ リヨウ シタ DNA テントツゼン ヘンイ ノ カイセキ

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抄録

正常型DNAから微量の変異DNAを識別する有力な手法の一つとして,ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)/リガーゼ検出反応(LDR)が知られている.本研究で行ったPCR/LDRアッセイでは,3'末端においてターゲットシークエンスの一塩基の差異をアレル特異的に認識し、3'末端がビオチン化された共通プライマーとライゲートする識別プライマーの5'末端が,異なる蛍光色素(ROX, HEX, TET, TAMRA)で標識されている.PCR/LDR反応によって得られたビオチン化LDRプロダクトは,ストレプトアビジンがコートされた磁性ビーズにビオチン-ストレプトアビジン結合を介し固定化された後、ビーズを磁石で回収・洗浄することにより精製された.その後,精製されたLDRプロダクトを,10 mM EDTAを含むホルムアミド中において75℃で5分間インキュベートすることにより,ビオチン-ストレプトアビジン結合を切断し,溶媒中に解離させた.回収されたLDRプロダクト溶液を含む溶液の蛍光スペクトルを蛍光分光光度計を用いて測定した.LDRプロダクトに標識されている上記蛍光色素の蛍光スペクトルの違いにより,K-ras遺伝子のエクソン1,コドン12.2における一塩基置換を迅速かつ簡便に特定することが可能となった.

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