ブタ子宮内膜におけるエストロジェンレセプターに対するエストロジェンおよびエストロジェン様化学物質の結合の競合

Evidences for xenobiotic chemical (XBC) induced reproductive disorders have been reported in wild animals and human, because XBCs act as the disruptor of the estrogen receptor (ER) in agonistic or antagonistic manner. There is no report about the binding competition of estrogen and XBCs to ER in the porcine endometrium. Therefore, we characterized and quantified the binding competition to ER between estrogen and six XBCs (diethylstilbestrol: DES, p,p-isopropylidenediphenol: Bis, p-n-nonylphenol: Non, daidzein:Da, coumestrol :Coum, bis (2-ethylhexyl) phthalate: Ph). To clarify ER characteristics, we carried out radio-receptor assay (RRA) of ER in the endometrium. Cytosolic and nuclear fractions were prepared from endometrial tissue with hypotonic 10mM Tris-HCl with l.5mM EDTA and 1mM dithiothreitol. To choose optimum conditions for RRA, both fractions were incubated with radioactive ligand (3^H-estradiol-17β- :3＾H-E_2) at 4, 20 or 37℃ for 0.5, 2, 4, 8 or 24h. ERs were identified in both fractions of the endometrium. Binding of 3＾H-E_2 depended on the protein amount, and reacted to the maximal at 24h and 2h after incubation, respectively at 4℃ and 37℃. Secondly, binding affinities were examined by Scachard analysis. Binding characteristics were varied on the stages of estrous cycle and the range of Kd and Bmax were 0.12～0.49nM and 0.12～0.015nmol/mg protein, respectively. Binding　competitions between 3^H-E_2 and E_2 or each of XBC were examined. Competition studies demonstrated that ER bound E_2 and XBCs with several degrees of binding affinity. Higher binding affinities of binding were found in Des, followed by E_2 and Non. Binding competitions of Coum, Bis, Da and Ph to E_2 were relatively low.

野生動物やヒトにおいて,エストロジェン様化学物質がエストロジェンのアゴニストあるいはアンタゴニストとしてエストロジェンレセプターと結合競合するために,内分泌かく乱物質として生殖障害を引き起こすことが報告されている。一方,ブタ子宮内膜におけるエストロジェンとエストロジェン様化学物質がエストロジェンレセプターヘの結合競合を示すか否かについての報告はこれまで無い。そのため,我々はブタ子宮内膜におけるエストロジェンレセプターヘのエストロジェンと5つのエストロジェン様化学物質の結合競合を明らかにしようとした。我々は子宮内膜におけるエストロジェンレセプターの性状を明らかにするため,放射レセプター測定法を実施した。子宮内膜の細胞質および核分画の調整は,1.5mM EDT A,1mM dithiothreitolを含む低張の1.5mM トリス—HCl緩衝液を用いて行った。放射レセプター測定法の最適条件を決定するため,両分画と放射性リガンドである3^H-estradiol-17β(E_2) を4, 20および37℃で0.5, 2, 4, 8および24時間反応させた。その結果,エストロジェンレセプターが子宮内膜の両分画に存在することが確認され,3^H-E_2の結合量は,分画のタンパク質量に依存し, 4℃で24 時間あるいは37℃で2 時間の反応で最大に達した。エストロジェンレセプターの結合定数は,放射レセプター測定法の結果をもとにSctachard分析で解析した。結合定数は,発情周期の時期によって変動し, K_bおよびB_maxは,それぞれ0.12～0.49nMと0.12～0.015nmol/mg proteinの範囲で推移した。3^H-E_2とE_2および各種エストロジェン様化学物質(diethylstilbestrol: DES,p,p-isopropylidenediphenol: Bis, p-n-nonylphenol: Non, daidzein: Da, coumestrol: Coum, bis (2-ethylhexyl) phthalate: Ph)との間での結合競合を検討した結果,エストロジェンレセプターはE_2およびエストロジェン様化学物質と種々の程度での親和性を示した。高い結合親和性は, Des, E_2, Nonの順であった。Coum, Bis, DaそしてPhの結合親和性は, E_2に比べて1,000から10,000分の1程度と低かった。