アセチルアセトンとホルムアルデヒドによる縮合反応を用いたHPLC/蛍光検出法による尿中δ-アミノレブリン酸定量法の改良

我々は尿中デルタアミノレブリン酸(δ-ALA)をアセチルアセトンとホルムアルデヒドを用いたプレカラム誘導体法によるHPLC-蛍光光度計で定量する方法が有用であることを先に報告した.しかしながら,その方法によるδ-ALAの回収率は尿中共存物質の影響を強く受け,尿中δ-ALAの回収率はやや低くなっていた(84.6±7.6%,n=45).本報告者は,我々は尿中δ-ALAの回収率がほぼ100%となるように方法を改善した(101.3±5.5%,n=45).この改訂法は以下の方法で行った: 尿20μl,アセチルアセトン溶液(アセチルアセトン: エチルアルコール: 4g/lの塩化ナトリウムを含有する蒸留水=15:10:75) 5ml,および9.3%ホルムアルデヒド溶液0.45mlを混合し沸騰浴で15分間反応させた後,流水で冷却し,その50μlをHPLC-蛍光光度計で測定した(励起波長246nm,測定波長458nm).δ-ALAの保持時間は7.3分であった.溶液グラジエント法を用いることによりカラム圧の上昇を避けられ,13分間隔での連続分析が可能となった.この方法によれば,種々の尿中共存物はδ-ALA誘導体の生成に影響を与えず,生成された誘導体はほぼ24時間安定であった.この方法で測定された尿中δ-ALA濃度はモーゼルーグラニック(M-G)法で測定した値と有意に相関した(n=85,r=0.993,p<0.001).しかしこの方法ではδ-ALAの類似物質を分離しているので,M-G法の値よりもこの方法による値のほうが低く,この方法による非鉛曝露作業者40名の尿中δ-ALA濃度は0.1〜2.3mg/g creatinine(1.1±0.4mg/g creatinine)と,M-G法による濃度(1.2〜3.1mg/g creatinine (2.1±0.5mg/g creatinine))の約半分の値であった.HPLC法による尿中ALA濃度の許容値は従来の比色法による数値とは異なった値を設する必要があると考えられる.
We improved the method for determining urinary δ-aminolevulinic acid (ALA) by HPLC-fluorometer after pre-column derivatization with acetylacetone and formaldehyde, and a stable ALA derivative was obtained without any effect from various urinary components as demonstrated by the complete recovery of ALA (100.9±5.5%, n=85) from the urine samples. The modified procedure was as follows: Twenty μl of urine sample, 5ml of acetylacetone solution (acetylacetone/ethanol/distilled water containing 4g/l of NaCl; 15/10/75), and 0.45ml of 9.3% formaldehyde solution were mixed and boiled for 15min. The fluorescent derivative of ALA was separated and analyzed by HPLC with the fluorometer at Ex 246nm and Em 458nm. Using a gradient program, the retention time of the ALA derivative was 7.3min and the analysis could be repeated at 13min intervals. Concentrations of ALA in urine samples measured by this method were significantly correlated with those measured by the Mauzerall-Granick (M-G) method (n=85, r=0.993, p<0.001). The values obtained by our method were, however, lower than those obtained by the M-G method. Urinary ALA concentrations of 40 non-lead workers ranged from 0.1 to 2.3mg/g creatinine with the mean±SD of 1.1±0.4mg/g creatinine as measured by the present method.